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在《Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice》文章中，確定了一個腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和單鏈向導RNA（sgRNA）系統，在選定的位點以最小限度的旁觀者編輯（bystander editing）和脫靶編輯可以有效地糾正MYH7基因上的p.R403Q致病變異（PV）。結果表明，在源自肥厚型心肌病（HCM）患者的誘導性多能干細胞（iPSc）心肌細胞和HCM人源化小鼠模型中，堿基編輯成分的傳遞可挽救HCM的病理表現。該研究證明了堿基編輯在治療遺傳性心臟病方面的潛力，并促進了腺嘌呤堿基編輯器療法的進一步發展，以糾正導致心臟病的單基因變異。

最常見的遺傳性心臟病是肥厚型心肌病（HCM），它是由編碼心肌肌小節相關蛋白的基因變異引起，并導致異常的心肌肥厚。HCM的并發癥包括心力衰竭、心律失常和心原性猝死。MYH7（編碼β-肌球蛋白）的顯性負向c.1208G>A（p.R403Q）變異是一種常見且研究充分的PV，可導致心臟收縮力增加和HCM發病。

HCM患者iPSCs的ABE糾正效率

為了將ABEmax-VRQR和h403_sgRNA系統應用于疾病模型，研究人員從2名攜帶MYH7^403/+ PV（HCM1^403/++和HCM2^403/+）的HCM患者中獲得了人類iPSCs。通過ABEmax-VRQR-P2a-EGFP和h403_sgRNA的質粒轉染、GFP+細胞熒光激活細胞分選來糾正MYH7^403/+變異（圖1a）。通過高通量測序（HTS），盡管有98%-99%的靶點編輯，但在使用生物信息學工具CRISPOR后確定的8個檢測候選脫靶基因座的所有58個腺嘌呤堿基上，脫靶DNA編輯極少甚至沒有（0.12%或更少）（圖1b）。結果表明，具有ABEmax-VRQR的h403_sgRNA可以有效且特異性地糾正目標致病性錯義變異，在檢測的脫靶位點僅需極少的旁觀者編輯和很少或沒有DNA編輯。

ABE編輯患者來源iPSC-CMs的功能分析

為了研究基因編輯糾正是否能減少HCM患者的超收縮力的產生，研究人員將iPSC-CMs以單細胞密度放置在柔軟的聚二甲基硅氧烷表面上，記錄心肌細胞（CMs）收縮的高幀率視頻并計算峰值收縮力（圖1c）。由于先前的研究表明p.R403Q HCM變異導致ATP消耗增加和細胞代謝改變，接著又通過基因編輯糾正后的代謝通量測定評估細胞能量學的變化（圖1d）。結果表明，在人類HCM的CMs中，PV的糾正足以挽救超收縮表型并恢復正常的細胞能量。

圖1. 基于堿基編輯糾正的HCM患者iPSC-CM的功能分析

HCM生物學人源化小鼠模型的建立

與人類心臟中主要表達的β-肌球蛋白重鏈異構體不同，成年小鼠心臟主要表達α-肌球蛋白重鏈異構體，由MYH6編碼。以往的HCM小鼠模型都是用MYH6突變直接替代MYH7突變以解釋表達差異，但這二者在蛋白編碼區并不是完全相同的，因此用于人類基因組的sgRNA和編輯策略無法直接應用至小鼠模型。為了使用人類序列特異性堿基編輯策略進行臨床前研究，研究人員建立了一個人源化小鼠模型，在小鼠MYH6基因中包含MYH7 c.1208G>A（p.R403Q）人類錯義變異，該基因也具有PV上游和下游的至少21個核苷酸的人類DNA序列同一性，以便檢測人類基因組特異性CRISPR策略。另一個MYH6等位基因包含未修飾的小鼠基因組序列。這種人源化小鼠模型（MYH6^h403/+）反映了先前描述的MYH6 p.R403Q小鼠模型的表型。

人類HCM小鼠模型的體內ABE治療

研究人員首先試圖通過挽救MYH6^h403/h403小鼠來驗證雙AAV9 ABE系統的效率，這些小鼠在出生后一周內就會死亡。值得注意的是，目前沒有報道人類患者具有純合子基因型。用生理鹽水、低劑量（4×1013 vg kg-1）或高劑量（1.5×1014 vg kg-1）的AAV9（低劑量共為8×1013 vg kg-1，高劑量共為3×1014 vg kg-1）向P0（出生后第0天）的MYH6^h403/h403幼崽胸腔內注射，并監測其發育情況。結果MYH6^h403/+和MYH6^WT小鼠在斷奶后存活并進入成年。高劑量小鼠心臟的互補DNA（cDNA）的Sanger測序表明，在轉錄水平上致病性核苷酸糾正了35%，這表明雙AAV9 ABE系統能夠在心臟中進行基因編輯（圖2）。

由于MYH7 p.R403Q變異僅以雜合形式存在于人類患者中，接下來又設置了雙AAV9 ABE系統來預防MYH6^h403/+小鼠中HCM疾病的發生。結果發現，與MYH6^WT對照組相比，MYH6^h403/+小鼠的HCM特征增加，包括舒張期左室前壁（LVAW）厚度增加和舒張期左室后壁（LVPW）厚度增加。這些小鼠在舒張期和收縮期的左室內徑減小，左室射血分數（EF）和左室縮短分數（FS）增加。MYH6^h403/+小鼠的心室壁厚度增加，心室直徑減小以及正常高值FS，這與人類患者的臨床進展一致。這些數據表明，雙AAV9 ABE系統治療足以預防HCM介導的心臟病理性重塑的發生（圖2）。

圖2. 對Myh6h403/+小鼠進行雙AAV9 ABE系統編輯預防HCM

而在《Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice》文章中，研究人員構建了可模擬人類肌球蛋白R403Q突變的小鼠模型，其病理特征和人類疾病表現類似，包括左心室肥大、心室腔縮小以及心肌纖維化。基于該動物模型，研究人員評估了兩種不同的基因療法——腺嘌呤堿基編輯器（ABE8e）和由AAV9遞送的強效Cas9核酸酶，來預防攜帶雜合HCM致病變異肌球蛋白R403Q的小鼠發生心臟病變。利用單劑量的AAV9雙載體，每個載體攜帶一半的RNA引導的ABE8e，糾正了≥70%的心室心肌細胞的致病變異，并保持了持久且正常的心臟結構和功能。額外的劑量雖然提升了心房處的編輯效率，但也增加了旁觀者編輯現象的發生。RNA引導的Cas9核酸酶的AAV9遞送有效地滅活了致病等位基因，但由于劑量依賴性的毒性，需要一個狹窄的治療窗口來維持健康。這些臨床前研究表明，單劑量基因療法在糾正或沉默致病變異、預防HCM發展方面具有相當大的潛力（圖3）。

圖3. 致病性變異R403Q的AAV9-Cas9沉默和R403Q-129SvEv小鼠的心臟功能

以上兩項基于基因編輯的新精準療法的臨床前研究，為HCM模型的成功基因編輯提供了希望，雖然將其轉化為人類患者還需面臨各種挑戰，但單劑量明確的治療方法不僅適用于HCM，也適用于基因敲除或過度表達策略不適用的眾多其他遺傳性綜合征，因此是一個非常值得追求的目標。在未來，基因編輯應用于臨床的精準治療指日可待！

參考文獻

[1] Chai AC, Cui M, Chemello F, et al. Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice. Nat Med, 2023 Feb; 29(2): 401-411.

[2] Reichart D, Newby GA, Wakimoto H, et al. Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice. Nat Med, 2023 Feb; 29(2): 412-421.